カルパインプロジェクトは、小野弥子主席研究員を筆頭として、東京大学大学院農学生命科学研究科応用生命科学専攻、科学技術振興機構らとの共同研究において、筋ジストロフィーの責任遺伝子産物でもあるカルパイン3^注1)（p94とも呼ばれる）というタンパク質分解酵素^注2)（プロテアーゼ）が、Ca²⁺の他に、Na⁺によっても特異的に活性化されること、また、Ca²⁺とNa⁺では異なった基質特異性を示すこと、などを明らかとしました。Na⁺によって活性化される酵素は、細胞外のものではいくつか知られていますが、細胞内のものでは今回が初めての報告となります。この発見は、カルパイン3の生理機能に重要なヒントを与えるのみならず、筋ジストロフィーの発症機序の解明に重要な手がかりを与えるものです。

この研究成果は、7月23日（米国東部時間）発行の米国科学雑誌「Journal of Biological Chemistry（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー）」で発表されました（オンライン版発表は5月11日（米国東部時間））。

なお、この研究は、東京都医学研究機構プロジェクト研究費、独立行政法人科学技術振興機構CREST、文部科学省科学研究費補助金特定領域研究、基盤研究(B)、厚生労働省精神･神経疾患研究委託費、武田科学振興財団特定研究助成金を活用して行われたものです。

カルパイン3（p94）は、「骨格筋特異的な発現」、「Ca²⁺が無い状態での強い自己分解活性」、「巨大筋弾性蛋白質コネクチンとの相互作用」、さらに「肢帯型筋ジストロフィー^注3)LGMD2A（カルパイノパチーとも呼びます）の責任遺伝子産物」、という極めて興味深い性質を持つプロテアーゼです。これらのユニークな性質は、カルパイン3の生理機能を反映するものと考えられ、即ち、カルパイノパチーの発症機序と深く関係すると考えられます。下図のように、カルパイン3は組織普遍的なカルパイン1及び2（コンベンショナルカルパインと呼ばれます）と同様に、プロテアーゼドメイン、Ca²⁺結合性C2ドメイン様ドメイン、及び5つのCa²⁺結合性EF-ハンドモチーフを持つドメイン（PEFドメイン）を持ちます。 さらに、IS1とIS2という領域が挿入されており、これらがカルパイン3に上記の特異的な性質を付与していると考えられます。

そこで今回、「Ca²⁺が無い状態での強い自己分解活性」について解析した結果、カルパイン3はカルパイン（Ca²⁺依存的に活性化されるプロテアーゼ）にも関わらず、Na⁺によっても活性化を受けることを明らかとしました。Na⁺濃度は、細胞外では145 mM程度ですが、細胞内では15 mM前後に抑えられており、これまで細胞内でNa⁺によって活性化される酵素は見つかっていませんでした。カルパイン3はその初めての例となります。本研究では、このNa⁺依存的なカルパイン3の活性について詳しく解析しました。

• カルパイン3のNa⁺依存性は構造のどの部分に由来するのかを解析するため、下図のように哺乳類カルパイン分子種のプロテアーゼドメインのアミノ酸配列を比較し、特にここに存在する2つのCa²⁺結合モチーフ（CBS-IIa及びCBS-IIb）に注目しました。他のドメインも含めて、様々な変異体を作製しそのNa⁺依存性などを解析した結果、CBS-IIaがCa²⁺に加えてNa⁺も結合するように進化したことが強く示唆されました。また、IS1、IS2及びドメインIIIがCBS-IIaのNa⁺結合性に寄与していることも明らかとなりました。






• そこで、カルパイン3のCa²⁺依存性の生理的意義を探るため、下図のようにプロテオームの手法を使い、基質のスクリーニングを行いました。骨格筋の抽出物をNa⁺またはCa²⁺存在下でインキュベートして、量の減少したものを同定した結果、驚くべき事にNa⁺でインキュベートしたときに量が減少する蛋白質とCa²⁺でインキュベートしたときに量が減少する蛋白質とは、ほとんど同じものが存在しませんでした。即ち、少なくともin vitroで、カルパイン3はNa⁺またはCa²⁺によって活性化されるときに、（基質の構造変化も含めて）異なる基質特異性を示すことが明らかとなりました。




• さらに、上図に示すような条件で同定した基質候補を絞り込み、下図のものをin vivoの基質候補として同定しました。いくつか筋原線維内の蛋白質が含まれています。




• また、実際にカルパイン3が筋細胞内でNa⁺の上昇に応じて自己消化する様子をリアルタイムの蛍光観察により示しました。（下のムービーを参照下さい）



ムービー：骨格筋初代培養細胞に発現させた野生型（上）及び不活性型（下）カルパイン3の自己消化の様子
初代培養細胞にGFPを融合させたカルパイン3を発現させ、ウアバイン（Na/K-ATPaseの特異的阻害剤で細胞内のNa⁺濃度を上昇させる）を添加したもの。野生型は約30分（ムービー上で15秒）でシグナル（カルパイン3はM線上に縞々に配向しています）が無くなりますが、不活性型はずっと残っています。（どちらのムービーも実時間の2分を1秒に短縮しています）


• 既述のように、細胞外酵素にはいくつかNa⁺依存性酵素が報告されており、下図のファクターXaもその一例です。しかもファクターXaはカルパイン3と同様にNa⁺とCa²⁺の両方を結合し、両方に依存的であることが分かっています。ただし、その濃度は、細胞外のそれぞれの濃度に相当する、150 mM及び1 mM程度が必要であり、細胞内のそれぞれの濃度に相当するカルパイン3の15 mM及び100 nMという高感度なイオン依存性とは明らかに異なっています。μ-カルパインのプロテアーゼドメインには、上述のように2分子のCa²⁺が結合しますが、このうちCBS-IIaが、さらにNa⁺も結合できるように構造的に進化を遂げたと考えられます。



それぞれの立体構造をpdfで表示できます。

ファクターXaはこちら

μ-カルパインプロテアーゼドメインはこちら

筋ジストロフィーであるカルパイノパチーの患者さんには、これまでにカルパイン3の分子全体に広がる、非常に多種類のミスセンス変異が見つかっており、この理由は不明でした。今回、カルパイン3のNa⁺依存性には、IS1, IS2, ドメインIIIなど、分子の広範にわたる部分が必要であることが明らかとなり、この理由を一部説明できるようになりました。即ち、カルパイン3は多くのアミノ酸残基の分子間相互作用により、高度な活性を実現しており、これらの変異はカルパイン3の活性を容易に損なってしまう、と言うことです。

一方、Na⁺とCa²⁺は、実はイオン半径がほとんど同じ（1.14Åと1.16Å）であり、わずかな構造変化によりCa²⁺結合サイトはNa⁺結合サイトに変化しうることも知られています。今回の結果は、今までCa²⁺依存性酵素と思われてきた細胞内酵素のいくつかは、実はNa⁺にも依存性が存在する可能性を示しており、細胞内シグナル伝達の概念を大きく変える可能性を秘めているかもしれません。

• 注1)　カルパイン3：カルパインは、体を構成する細胞内において様々な機能調節に関わるプロテアーゼで、細胞内のカルシウムが結合することにより酵素機能を発揮します。哺乳動物には15種類のカルパインが存在し、カルパイン3はほぼ骨格筋のみに見られる酵素で、この酵素活性が不全となると、肢帯型筋ジストロフィー2A型（カルパイノパチーとも呼ばれます）を発症してしまいます。カルパイン3以外にも数種のカルパインが胃腸疾患（カルパイン8及び9）、糖尿病（カルパイン10）、アルツハイマー病（カルパイン1と2）などの治療の標的として注目されています。


• 注2)　プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）：タンパク質はアミノ酸が数十～数万個つながって出来たものですが、このつながりの切断反応を行う酵素です。人間には500種類以上のプロテアーゼの遺伝子が存在し、消化、免疫、癌転移、発生、生殖など様々な生命現象に関与しています。プロテアーゼ自身もタンパク質でできており、また、細胞内には様々なタンパク質が働いているため、その活性は厳密に制御されています。


• 注3)　肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）：筋ジストロ フィーは、年齢と共に筋肉が進行性に萎縮していく遺伝病で、まだ決定的な治療法が見つかっていない難病です。肢帯型は腹部に近い筋肉が主に萎縮するもの で、十数種の責任遺伝子が知られており、その一つがカルパイン3です。この変異が原因で起こるものを2A型（即ちLGMD2A）といい、カルパイン不全で生じるため「カルパイノパチー」とも呼びます。LGMDの中では 最も頻度の高いもので、世界的には約5万人に一人の割合で発症します。