研究概要

プロジェクトの目的

 本プロジェクトは、ヒト感覚器疾患の発症機構の解明および有効な予防法を開発するため、ヒト疾患モデルマウスから順遺伝学的アプローチによる疾患発症に関与する遺伝子(群)の同定を最大の目的として研究を行っている。マウスはヒト疾患の原因解明のための最も有用なモデル動物であり、特に我々がこれまで行ってきた順・逆遺伝学的解析は、疾患の原因解明にとって極めて強力なアプローチとなっており、マウスにおける先行研究がヒト疾患の発症原因遺伝子の同定へと直結した例は極めて多い。さらに外部環境の影響を多大に受ける感覚器疾患においては、飼育室内環境を容易に調節しうるマウスの実験系は、より精密な疾患研究を可能にする。これらの利点を最大限に生かし、我々は感覚器疾患の中でも聴覚障害および視覚障害に焦点を絞り、順遺伝学およびゲノム科学の解析手段を併用して、ヒト疾患モデルの病態発症に関与する遺伝子(群)の同定することをプロジェクトの目的として研究に取り組んでいる。さらに、これらのモデルに核およびミトコンドリアゲノムの遺伝的背景が異なる様々な近交系との交配によって、病態の重篤度に対する変化を導き出し、それら病態修飾に関与する遺伝子の同定も目指している。

研究方法

 (1)聴覚障害および(2)視覚障害についてそれぞれの疾患のモデルマウスから順遺伝学に基づき主要原因遺伝子または修飾遺伝子を同定し、これを出発点としてヒト疾患発症に関与する遺伝子群を同定するものである。図1には疾患原因遺伝子の同定への実験手順を示しており、その手法は系統間交配群を作製し、これらの表現型と遺伝子型の連鎖解析によって明らかとした突然変異が存在する染色体上の位置情報を出発点とし、原因遺伝子を同定するポジショナルクローニングに順じて解析を実施している。また、我々は主働原因遺伝子の効果を修飾する遺伝子群同定を同定するため、ヒト疾患モデルマウスと日本産野生マウス由来の近交系を含む様々なマウス系統との交配後、主要発症原因遺伝子の同定時と同様に順遺伝学に基づく解析に、網羅的トランスクリプトーム解析を加えることによって、表現型と遺伝子型または遺伝子発現レベルとの相関解析を行うことにより疾患発症に関連する遺伝子の同定を目指している。さらに、同定した視聴覚疾患発症関連遺伝子群は分子生物学的な解析を行うとともに、逆遺伝学の手法によって同定した疾患関連遺伝子の機能を評価し、新たな視聴覚障害のモデルマウスを樹立する。

図1.視聴覚疾患モデルマウスからの原因遺伝子の同定

主要研究テーマ

(1)聴覚障害モデルマウスからの発症原因遺伝子の同定および機能解析

①先天性難聴発症モデルマウスの発症原因遺伝子の同定と機能解析

 現在我々は内耳有毛細胞の感覚毛(stereocilia)形成異常を示す3種先天性難聴モデルマウス、NOD/Shi (NOD), Rinshoken shaker/waltzer (rsv) およびKumamoto shaker/waltzer (ksv) からポジショナルクローニングの手法に従って原因遺伝子の同定を行っている。
 また、これらの新規難聴モデルマウスに加え、我々は数種の感覚毛異常の先天 性難聴モデルマウスの原因遺伝子を同定している(図2A)。これらは主にヒト Usher症候群の原因遺伝子がコードする蛋白質ネットワークのメンバーであり (図2B)、このネットワークが感覚毛形成・維持に重要な役割をもつことが明ら かになりつつある。そこで我々はこれらUsher蛋白質の発現を調査し(図3B)、 さらにこのネットワークの新たなメンバーのスクリーニングを行っている。

図2.Usher蛋白質SANSの内耳有毛細胞における機能

②近交系マウスをモデルとした加齢性難聴原因遺伝子の同定

 マウスには400種を超える近交系が樹立されており、これらの近交系間は多様な聴力差が認められる。図3Aには我々が数種の近交系マウスの聴力測定を経時的に行った結果を示しており、C3H/HeNおよびMSM/Ms系統は生後12ヶ月齢まで安定した聴力を示すが、C57BL/6J系統は加齢性難聴を、DBA/2J は早期の聴力低下を示す。この聴力差の主要な原因はカドヘリン23の遺伝子多型によることが明らかとなっているが(図3B)、それぞれの系統には複数の感受性遺伝子が存在し、この感受性遺伝子の多型によって難聴発症時期が修飾される。そこで我々はこのような系統間の難聴発症時期を修飾する遺伝子の探索を行っている。

図3.マウス近交系間の聴力差とCdh23遺伝子の多型

(2)視覚障害モデルマウスおよびラットを用いた発症修飾遺伝子の同定
   および機能解析

①白内障モデルFoxe3rctマウスおよびKFRS4ラットの水晶体混濁に関わる遺伝子の同定と白内障発症時期修飾遺伝子の同定

 白内障モデルマウスRinsyoken cataract(rct)は約2-3ヶ月齢で肉眼により白内障を発症する(図4)。我々はrctマウスの白内障発症に関わる突然変異の探索をポジショナルクリーニングにより行っている。
また、同様に先天性白内障を示すKFRS4ラットについても同様の解析を行っている。
一方、Foxe3rctとMSMとの交配実験によって白内障発症時期を早期化する修飾遺伝子(modifier of rct; mrct)の存在が明らかとなっている。そこでこのmrctの同定を遺伝学的解析により行っている。

図4.Rinshoken cataract(rct)マウスの水晶体の混濁

②小眼球モデルPitx3sampマウスの突然変異の同定

 Saitama microphthalmos (samp) は日本産野生マウスKOR1に自然発症した小眼球モデルである(図5)。我々はこのマウスの小眼球発症を規定する遺伝子の同定をポジショナルクローニングによって行っている。

図5.日本産野生マウス由来の近交系KORマウスに出現した小眼球マウス(Saitama microphthalmos:samp)

発表論文の概要

愛玩用ラットから樹立した白内障ラットの発症原因遺伝子の同定

 私たちは、ナショナルバイオリソースプロジェクト「ラット」において愛玩用ラットから樹立された新たな白内障発症モデルであるKFRS4ラットの白内障発症原因が、水晶体細胞の主要な膜タンパク質であるMIP (major intrinsic protein of eye lens fibre gene, またはアクアポリン0とも呼ばれている) をコードするMip遺伝子に生じた5塩基の挿入変異であることを明らかにしました。
 Mip遺伝子の変異は、これまでヒトとマウスで発見されており、白内障発症の原因となることは既に報告されていましたが、今回私たちはMip変異を初めてラットで発見しました。さらに面白いことに、ヒトやマウスでは、Mip変異による白内障は、優性遺伝することが知られていましたが、KFRS4ラットの白内障は劣性遺伝することが詳細な病態解析、遺伝子・タンパク質発現解析によって明らかとなりました。

  • 渡部桂 他.PLoS One 7 (11), e50737. [PubMed]


  • 誘導型の好塩基球除去マウスおよび好酸球除去マウスの開発

     好塩基球や好酸球は白血球の一種で、細菌や寄生虫などの外敵から身を守る生体防御に重要な役割を担っていますが、アレルギーにおいては炎症の増悪因子としてはたらいてしまいます。私達は、好塩基球と好酸球の生体内での機能を詳細に調べるためのマウスモデルとして、誘導型の好塩基球除去マウスおよび好酸球除去マウスをそれぞれ開発しました。これらは、好塩基球に特異的なCD203cあるいは好酸球に特異的な好酸球ペルオキシダーゼのプロモーターでジフテリア毒素受容体(hDTR)の発現を制御するトランスジェニックマウスで、マウスはジフテリア毒素(DT)に耐性であるため、DTを投与することにより標的とする細胞のみを殺すことができます。
     これらのマウスにおけるDT投与の効果は、好塩基球が引き金を引き、強い好酸球浸潤を伴う皮膚腫脹反応として知られるIgE依存性慢性皮膚炎症(IgE-CAI)を指標に調べました。誘導型好塩基球除去マウスでは、DTを投与すると末梢血中の好塩基球が著しく減少し、IgE-CAIが完全に抑制されました。誘導型好酸球除去マウスでは、DTの投与により末梢血中の好酸球が減少し、IgE-CAIによる皮膚炎症局所への浸潤好酸球数が激減し、皮膚腫脹が軽減しました。これらのマウスのIgE-CAI炎症局所のサイトカインやケモカインを詳細に解析した結果、eotaxin-2というケモカインによって好酸球が遊走するらしいことが判りました。樹立したマウスモデルを組み合わせることにより、アトピー性皮膚炎や喘息などのアレルギー性炎症のメカニズムの解明に役立つと期待されます。

  • 松岡邦枝 他.PLoS One 8 (4), e60958. [PubMed]


  • TRECK法によるI型糖尿病モデルマウスの開発

     I型糖尿病は、血糖値を下げる唯一のホルモンであるインスリンを分泌する膵臓β細胞が損傷を受けて発症します。これまで、高血糖モデルマウスを得るためにはストレプトゾトシンやアロキサン等の薬剤を投与して高血糖を誘発する方法が一般的でしたが、個体によるバラツキが大きい、腎毒性がある等の問題がありました。そこで、私達はTRECK法という方法を用いて、膵臓β細胞を特異的に破壊することのできるマウスを新しく2種類開発しました。1つは、ヒトのインスリンプロモーターを用いてジフテリア毒素受容体(DTR)の発現を制御するマウスで、免疫に重要なリンパ球を欠損した重症複合免疫不全(scid)を背景に作製しました(SCID-INS-TRECK-Tg)。もう1つはプロモーターにマウスインスリン2のBACを用いてDTRを発現させるB6-ins2(BAC)-TRECK-Tgマウスです。これらのマウスは膵臓β細胞のみにDTRを発現しており、ジフテリア毒素(DT)を投与すると膵臓β細胞が特異的に破壊され、インスリンを産生することができず高血糖となります。これらのマウスの開発を通して、TRECK法でマウスを樹立する際には、短いプロモーターよりもBACプロモーターを用いた方が効率的であることが判りました。
     SCID-INS-TRECK-Tgマウスを用いて、詳細な解析を行いました。このマウスはDTを投与しなければ健康ですが、DTを投与すると膵臓β細胞が1/10以下に減少し、1週間以内に血糖値が600 mg/dl以上にも上昇してしまいます。このマウスが免疫不全であることを利用して、移植による高血糖の改善を試みました。異種マウスであるB6マウスの膵臓からβ細胞を含むランゲルハンス島を取り出し、腎臓の皮膜下に移植すると、その場所に生着してインスリンを分泌し、血糖値が正常値になりました。また、ヒトの臍帯血に含まれる未熟な幹細胞(CD34陽性細胞)を移入すると高血糖が改善しました。開発したマウスはこれまでの薬剤を用いる方法に比べて、より確実に、また二次的障害を与えずに高血糖症を誘導することができ、I型糖尿病の治療法の開発やβ細胞の幹細胞の探索等に大きな威力を発揮すると期待されます。

  • 松岡邦枝 他.Biochem. Biophys. Res. Commun. 436 (3), 400-405. [PubMed]


  • マウスにおけるカドヘリン23の機能欠損Cdh23v-ngtアレルとハイポモルフCdh23ahlアレルのヘテロ接合体は早発性・加齢性難聴を発症する

     waltzer niigata (Cdh23v-ngt) マウスは、Cadherin 23 (Cdh23) の突然変異体であり、内耳有毛細胞の感覚毛の形成不全による先天性難聴および平衡感覚異常を発症します。一方、多くの近交系マウスが保有するハイポモルフCdh23ahlアレルは、マウス加齢性難聴の発症に関与します。本研究では、機能欠損Cdh23v-ngtアレルとハイポモルフCdh23ahlアレルの複合ヘテロ接合体 (Cdh23v-ngt/ahl) を作製し、長期的な聴覚の表現型解析および遺伝子発現解析を行うことで、Cdh23の加齢性難聴へ与える影響を検証しました。その結果、Cdh23v-ngt/ahlヘテロ接合体はCdh23ahl/ahlホモ接合体に比べてCdh23の発現量が低下し、早期の聴力低下が認められました。さらに、Cdh23v-ngt/ahlヘテロ接合体の聴力低下は加齢に伴い進行し、感覚毛の崩壊に起因することも明らかとなりました。内耳有毛細胞においてCDH23は、感覚毛間をつなぐチップリンクに局在しており、Cdh23遺伝子の発現量が減少することで、感覚毛間の「張力(tension)」が緩み、感覚毛が崩壊し、「聴力」の早期低下を引き起こしたと考えられます。これらの結果からCDH23は老化プロセスにおけるチップリンクの維持に必須の蛋白質であることが示唆されます。

  • 宮坂勇輝 他.Exp Anim, 62 (4), 333-346. [PubMed]


  • 小眼球症モデルマウスの発症原因は転写調節因子であるPitx3遺伝子に生じた突然変異である。

     小眼球症は重篤な眼疾患です。私たちは小眼球症のモデルマウス(図1)の発症の原因が眼の形成に重要な役割をもつ転写調節因子であるPitx3遺伝子に生じた突然変異であることを突き止めました。この変異によってPitx3遺伝子がコードするタンパク質は、カルボキシル末端側のOARドメインが欠損し(図2)、さらに小眼球マウスの眼球ではこの異常タンパク質が過剰発現することが明らかとなりました(図3)。また、この異常タンパク質の過剰発現によってPitx3の下流に存在する眼球形成に重要な遺伝子Foxe3, Prox1, Mipに加え、クリスタリンタンパク質群の発現が抑制されていることも示されました。これらの結果は、眼の形成およびPITX3タンパク質のOARドメインの機能を理解する上で重要な知見であります。

  • 和田健太 他.PLoS One, 27 (9), e111432. [PubMed]


  • DBA/2Jマウスにおける周波数特異的な聴力に効果をもつ第5番染色体上の感受性遺伝子座。

     DBA/2Jマウス系統はヒトの早発性進行性難聴のモデルマウスとして知られ、超音波から低周波数領域にかけて聴力が低下し、重度難聴を発症します(図1)。その早発性難聴の遺伝的な原因としては、cadherin 23遺伝子のahlアレル (Cdh23ahl) およびfascin 2遺伝子のahl8アレル (Fscn2ahl8) の効果が報告されています。今回私たちは、DBA/2Jマウスに遅発性難聴モデルマウスであるC57BL/6Jマウスを交配して作製した戻し交配個体群を用いた遺伝学的解析によって、16 kHzの聴力においてはFscn2ahl8アレルの効果に加え、第5番染色体上の50.3~54.5, 64.6~119.9および119.9~137 Mbの3領域にDBA/2Jマウスの難聴発症に関与する遺伝子座が存在することを明らかにしました(図2)。また、DBA/2Jマウスの超音波周波数である32 kHzの聴力においてはFscn2ahl8アレルの効果は検出されず、さらに、超音波周波数においてはCdh23ahlアレルに加えて優性効果をもつ遺伝子座の存在を示すデータを得られました。従って、DBA/2Jマウスの早発性難聴は、その遺伝的背景に存在する周波数特異的な聴力機能に作用する遺伝子群によって支配されていることが明らかとなり、本論文によって、DBA/2Jマウスのヒト難聴発症のモデル動物としての新たな可能性を示すことが出来ました。

  • 鈴木沙理 他.Exp Anim, 64 (3), 241-251. [PubMed]


  • マウスにおけるUsh1g/Sans遺伝子のヘテロ接合変異は早発・進行性難聴の原因であり、その難聴発症はカドヘリン23遺伝子のマウス系統特異的変異の修復によって回復した

     難聴は1,000人に1人と高頻度で発症する感覚器疾患です。近年、難聴発症の原因となる変異は多くの患者で発見されていますが、同一の難聴発症原因遺伝子に生じた類似した変異でもその病態が大きく異なることが報告されています。その原因は各個人の「遺伝的背景」、すなわちゲノムの多型の違いが難聴発症原因遺伝子と関連することが昔から推定されていましたが、その証明はなされていませんでした。そこで私たちは難聴モデルマウスを用いてこの現象を検証しました。
     私たちは難聴モデルマウスの一系統であり、ヒト難聴の発症原因遺伝子であるSans (Ush1g) 遺伝子変異が劣性ホモの状態で重度難聴を発症するジャクソンシェーカー(js)マウスが、ヘテロ変異でも早発型の優性難聴を発症することを明らかにし、同時にjsマウスの難聴は、交配するマウス系統によってその病態が大きく異なることを見出しました。そこで私たちは順遺伝学的解析を実施し、優性難聴発症に関与する遺伝子座、カドヘリン23(Cdh23)を同定しました。さらに私たちは、Cdh23に存在するマウス間のDNA変異(ahl変異:753A)をCRISPR/Cas9システムを介したゲノム編集によって修復しました。その結果、jsマウスの難聴発症は完全に回復しました。これらの実験結果から、私たちはjsヘテロマウスの早発型進行性難聴の発症が2つの遺伝子に生じた変異の相互作用効果によって成立することを塩基置換レベルで実証することに成功しました。
     また、この研究は日本学術振興会科研費の基盤研究B(20300147, 23300160および15H04291:代表・吉川欣亮)および特別研究員奨励費(14J06119:代表・宮坂勇輝)の助成を受け実施しました。

  • 宮坂勇輝 他.Hum Mol Genet, 25 (10), 2045-2059. [PubMed]


  • マウスミオシンVIの新規スプライス変異は内耳有毛細胞における頂部領域のアクチンネットワークの破綻を引き起こす

     非筋肉性モータータンパクの一種であるミオシン VI遺伝子 (Myo6) はヒトとマウスに共通の難聴原因遺伝子です。私たちは内耳感覚毛の融合に起因した先天性の平衡異常および聴力欠損を発症するKumamoto shaker/waltzer (ksv) マウスを発見し、ポジショナルクローニングによってMyo6に未報告のスプライス変異を同定しました。このマウスの感覚毛融合過程を電子顕微鏡により詳細に観察した結果、感覚毛融合は感覚毛の極性異常、感覚毛束間の融合、有毛細胞頂部のアクチン細胞骨格であるクチクラ板の隆起および陥入による感覚毛-クチクラ板間の融合が起こることを示唆するデータが得られました。また、クチクラ板で特異的に発現するタンパク質を染色した結果、ksvマウスの感覚毛ではこのタンパク質の存在を示唆する強いシグナルが得られ、電子顕微鏡観察のデータから示唆されたデータが実証されました。さらに、私たちはksvマウスの感覚毛を感覚毛の根部で特異的に発現するタンパク質で染色した結果、ksvマウスでは根部が異常に伸長していることを示すデータが得られました。有毛細胞の感覚毛、根部およびクチクラ板はそれぞれが区別されたアクチン繊維構造によって形成されており、Myo6変異によりこれらの区別が破綻し、Myo6変異マウスでは感覚毛が融合するものと推察され、Myo6はこれらの構造の維持に重要な役割をもつことが強く示唆されました。
     本研究は日本学術振興会科研費基盤B(JP23300160)、挑戦的萌芽研究(JP15K15625)および若手研究B(JP15K18393)の助成を受け実施しました。

  • 関 優太 他.PLoS One, 12, e0183477. [PubMed]


  • Foxe3変異に起因した白内障発症はPde6b変異によって修飾される

     私たちは以前マウス早発性白内障の原因となるFoxe3遺伝子のrct変異をSJL/Jというマウス系統に発見しました。また、私たちは同時にこのマウスの白内障発症が早期におこる原因がSJL/Jマウスの遺伝的背景に存在し、網膜色素変性症の原因となるPde6b遺伝子の変異であることを強く示唆するデータを得ていました。そこで本研究において私たちは交配実験によってFoxe3rct変異を、Pde6b変異を保有しないマウス系統に導入したコンジェニックマウスを作製しました。その結果、このマウスは白内障発症時期が大きく遅延し、病態も軽度化しました。さらに私たちは野生型のPde6bアレルを含むBACクローンをトランスジェネシスによってSJL/J- Foxe3rctマウスに導入しました。作製されたマウスもコンジェニックマウス同様に白内障発症時期の遅延および病態の軽度化が認められたことから、SJL/J- Foxe3rctマウスの白内障の病態はPde6b変異との相加的果により重篤化することが実証されました。
     本研究は日本学術振興会科研費基盤S(JP16H06383)および若手研究B(JP24700437)の助成を受け実施しました。

  • 和田健太 他.Biochem Biophys Res Commun, 496, 231-237. [PubMed]


  • マウスの聴力低下における遺伝的背景の感受性効果

     加齢性難聴および騒音性難聴などの後天性難聴の病態は多様であり、その原因の1つは遺伝的背景に潜む病態修飾効果をもつゲノム多型であることが知られています。このような多様性はヒトのモデル動物であるマウスにおいても認められており、多くの研究者がマウスを使って病態修飾効果の研究を進めてきました。私たちは、今回発表した総説論文において、マウスを用いた聴覚の病態を修飾する遺伝的背景効果の研究、特に修飾遺伝子およびゲノム多型の同定のための研究方法および研究例について紹介しています。ご興味のある方は以下のウェブサイトからダウンロードしてください(無料)。

  • 安田俊平 他.An Excursus into Hearing Loss (Edited by: S. Hatzopoulos and A. Ciorba), IntechOpen, London., UK, pp. 3–23. [Book]


  • 新しい内耳外有毛細胞欠損モデルマウスの開発

     内耳外有毛細胞(OHC)は伸縮運動することにより、微弱な音を増大し、逆に強すぎる音は抑制的に伝達するという「聞こえの調節」をしています。ヒトが鋭敏な聴力を得られるのはこのためで、OHCの異常は難聴の発症に直結します。OHCは弱い細胞で、細菌やウイルスの感染、騒音への曝露、アミノグリコシド系抗生剤の投与等によって損傷を受け、また、加齢によってもその数は減少します。高齢者に難聴患者が多いのはそのためですが、根本的な治療法はなく、補聴器や人工内耳の装用により聴力を補わざるを得ません。加齢性難聴は人類で最も多い慢性疾患の一つであり、OHCの機能メカニズムを明らかにすることが難聴の予防や治療法の開発の基礎となると期待されます。そこで私達は、OHCの分子メカニズムを解明するためのツールとして、TRECK法という方法でジフテリア毒素(DT)の投与により任意の時期にOHCを誘導的に破壊することのできるマウスモデル(Prestin-hDTRマウス)を開発しました。
     Prestin-hDTRマウスにDTを投与すると、内耳の蝸牛および前庭に存在する他の細胞には影響を与えず、OHCのみが特異的に破壊されました(図1)。OHCが破壊されたマウスは、OHC特有の伸縮運動を反映する歪成分耳音響放射(DPOAE)が消失し、重度の難聴となりました(図2)。OHCを欠失したことにより引き起こされる遺伝子の発現変動をマイクロアレイで網羅的に比較した結果、免疫反応に関連する遺伝子の発現がOHC破壊マウスの蝸牛で増加していることが明らかとなり、OHCの細胞死に対する対応と考えられました。一方、OHC破壊マウスで著しい発現減少が認められる遺伝子には、難聴原因遺伝子や聴覚関連遺伝子の他、聴覚における役割の知られていない遺伝子も含まれていました。これらの結果から、本研究で樹立したPrestin-hDTRマウスはOHCの細胞死に関連する遺伝子の同定に極めて有用なツールとして期待されます。
     本研究は日本学術振興会科研費基盤C(JP24500502およびJP15K06818)および基盤B(JP16H04688)、および株式会社ケー・エー・シー創立35周年記念研究助成の助成を受け実施しました。

  • 松岡邦枝 他.Sci Rep, 9, 5285. [PubMed]

  • 所在地
    〒156-8506
    東京都世田谷区上北沢
    2-1-6
    東京都医学総合研究所