再生医療プロジェクト 研究員高橋 剛
CRISPR-Cas9 は最も普及しているゲノム編集ツールであり、改変したい標的 DNA 配列を Cas9 酵素で切断し、細胞の DNA 修復機構を惹起することで DNA 配列を改変しています。DNA 修復機構は、HDR（相同組換）と NHEJ（非相同末端結合）の 2 経路に大別でき、特に HDR は、ドナーDNA との組換を介して狙い通りの DNA 配列に改変できるため、医療応用に重要です。一方の NHEJ は、Cas9 が切断した DNA を迅速に繋ぎ直しますが、結合部にランダムな挿入や欠失を生じます。HDR と NHEJ のいずれかを選択的に誘導する技術は確立されていないため、編集後の標的配列は、HDR と NHEJ、あるいは編集が生じない WT（野生型）の対立遺伝子のいずれかとなります。また、二倍体であるヒト細胞は、1 つの細胞の中で同じ遺伝子を 2 つ（培養細胞株の場合は 2 つ以上）維持していますので、標的配列を複数持ちます。したがって、編集後の細胞の遺伝型は、対立遺伝子と標的配列の組合せの数だけ存在することになります。編集後の細胞の遺伝型を正確に把握することは、ゲノム編集による治療効果を評価するために極めて重要です。しかし、従来のゲノム編集結果の解析では、遺伝型を細胞集団レベルでしか解析しないため、個々の細胞に誘導されるゲノム編集結果の正確な把握が必要とされていました。
そこで私達は、自動１細胞分注機である Single Particle isolation System (SPiS) を活用し、ゲノム編集したヒト培養細胞から、2,600 株を超えるクローンを樹立することに成功しました。全てのクローンの遺伝型を解析した結果、 1 細胞レベルでは、ゲノム編集が全く生じない細胞と、全ての標的配列が編集された細胞に二極化することが明らかとなりました。さらに、全ての標的配列が編集された細胞では、HDR による改変と、ランダムな NHEJ による改変とが、同時に発生する傾向があることを突き止めました（図）。
本研究は、これまで知られていなかった CRISPR-Cas9の本質的な編集パターンを明らかとしました。今後は、ゲノム編集を利用した遺伝子治療法の開発につなげるため、この二極化した編集が生じるメカニズムの解析を進めていきたいと考えています。
Takahashi G, Kondo D, Maeda M, Morishita Y, Miyaoka Y.
Genome editing is induced in a binary manner in single human cells.
iScience. 2022, 25(12):105619
DOI：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.105619
