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CRISPR/Cas9によるDNA組換えを介した正確なゲノム編集を促進する条件を発見

「Nucleic Acids Research」に再生医療プロジェクトの加藤-乾朋子、高橋剛、許絲茵、宮岡佑一郎研究員らの研究成果が発表されました。

再生医療プロジェクト プロジェクトリーダー宮岡 佑一郎

ここ数年で目覚ましい発展を遂げているゲノム編集は、遺伝情報であるDNA配列の自在な改変を、ヒトを含むあらゆる生物種で可能にする画期的な技術です。ゲノム編集技術の中心的なツールであるCRISPR/Cas9は、編集したい部位と同一の配列を持つことで、標的ゲノムDNA配列を指定するgRNA（ガイドRNA）と呼ばれるRNA分子が、DNA切断酵素であるCas9をゲノムDNAの標的部位に誘導し、DNA切断を引き起こします。細胞は、切断されたDNAを修復しようとします。この修復反応をうまく利用し、目的とするDNA配列の改変を行うのがゲノム編集の基本的な考え方です（図1）。DNA切断に対する細胞のDNA修復機構には、主にHDR（相同組換え）とNHEJ（非相同末端結合）と呼ばれる、2つの経路が存在します。HDRにおいて細胞は、DNA切断部位と類似した配列を持つDNAを鋳型（修復のためのお手本）として、その鋳型DNA配列通りの、正確な修復を行います。したがって、改変したいDNA配列を含んだ鋳型DNAを細胞に提供することで、ゲノムDNAにその改変を導入できるのです。一方NHEJでは、細胞は切断されたDNAの両端を、ランダムなDNAの挿入や欠失を伴いながら結合します（図1）。そのため、HDRによる設計通りの正確なゲノム編集を望む際に、予測不能な挿入や欠失を起こすNHEJは不必要な副産物となってしまいます。しかし、HDRとNHEJのバランスが決まる仕組みは、不明でした。

今回、私達は標的であるゲノムDNAと、Cas9とgRNAの複合体が互いに結合し、作用し合う仕組みが、Cas9の引き起こすHDRとNHEJの頻度に大きく影響することを見出しました。もともと、Cas9とgRNAの複合体には、ゲノム中の標的部位以外の箇所を間違って切断しないために、構造チェックポイントと呼ばれる仕組みがあります。このチェックポイントは、Cas9-gRNA複合体がゲノムDNAに結合した際に、gRNAとゲノムDNAの配列が合致し、本当に標的ゲノムDNA配列であるかを、Cas9とDNAが互いに作用し合いながら、確認する仕組みです。私達は、この本来は標的DNAを正しく認識するための相互作用が、HDRとNHEJのバランスを決める可能性について検討しました。そのために、Cas9へのアミノ酸の変異導入や、gRNAの配列や長さの改変によって、構造チェックポイントの強度を調節して、ゲノム編集を行いました。その結果、構造チェックポイントを強化すると、HDRが亢進し、NHEJが抑制される場合が多いことが明らかになりました。しかし、強度を高めすぎるとゲノム編集自体が起こらなくなるため、構造チェックポイントには、HDRを亢進しNHEJを抑制する至適な強度が存在することを見出しました（図2）。この傾向は、DNA配列の一塩基だけを改変する一塩基置換でも、4000塩基ほどの長いDNA断片のノックインでも、共に認められました。従来から使われているCas9が、HDR誘導には必ずしも最適なツールではないことが明らかになりましたが、CRISPR/Cas9は、もともと細菌の免疫機構であり、それを私達が哺乳類細胞のゲノム編集に応用しているということを考えれば、まだまだ改良の余地のあるツールであるということも至極当然と考えられます。本研究の成果は、正確なゲノム編集をもたらすHDRをより効率的に誘導するゲノム編集ツールの開発、ひいては疾患の原因となるDNAの異常をゲノム編集で修正する治療法の開発へとつながることが期待されます。

図1. CRISPR/Cas9によるHDRとNHEJを介したゲノム編集

図2. 構造チェックポイントの強度とHDR/NHEJ誘導活性の関係、およびそのゲノム編集への応用

参考文献

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 with improved proof-reading enhances homology-directed repair.
Kato-Inui T, Takahashi G, Hsu S, Miyaoka Y.
Nucleic Acids Res . 46(9):4677-4688.
doi: 10.1093/nar/gky264.

宮岡 佑一郎 副参事研究員（中央）
生体分子先端研究分野 再生医療プロジェクト プロジェクトリーダー

2016年1月より開始したプロジェクトです。宮岡の留学からの帰国と同時に立ち上がったため、空っぽの研究室とともに、ゼロからスタートしました。研究所のみなさんのご支援のもと、研究室の人数も増え、研究の活性も高くなってきました。そんな中、私が研究室開始直後から取り組み始めたテーマを、加藤研究員を中心に研究室全員の力を結集して発展させ、研究室から初の論文として発表することができました。

新年の目標

研究室初の論文発表も行うこともでき、研究室の基盤ができてきたと判断し、今年から学生を受け入れることにしました。学生にとって研究室にいる時間が有意義なものになるように、自身の経験も交えながら、研究の素晴らしさを伝えていきたいと思います。

また研究面では、再生医療プロジェクトの今後の方向性を左右するような独自のテーマがいくつか進んでいます。それらが良い方向に向かうようにしっかりとした舵取りを心がけ、医学研第４期プロジェクトにおいても、再生医療プロジェクトとして研究が続けられるように精進したいと思います。